РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Генные пушкари: Генетики не ждут милостей от природы

Статьи о достижениях биотехнологий напоминают военные репортажи: стреляют генные пушки, применяются вирусные и бактериальные средства доставки, а в штабах занимаются чтением шифровок – текстов, написанных четырех- и двадцатибуквенными алфавитами.
Популярная механика
Популярная механика редакция

Шифровка из штаба

Представьте себе ленту километровой длины, покрытую вот таким текстом: ATGACCCCCGATCA GAGCG, — причем неизвестно, справа налево его надо читать или наоборот. Если вспомнить, что обозначают эти буквы основания ДНК — аденин, тимин, гуанин и цитозин, — станет понятнее, но ненамного. Следующий шаг — деление текста на слова из трех букв.

В молекуле ДНК 64 возможные трехзначные комбинации из четырех нуклеотидных оснований кодируют 20 аминокислот, из которых состоят все существующие на этой планете белки. Переводчиком в клетке служит матричная рибонуклеиновая кислота — мРНК. Ее алфавит тоже состоит из четырех букв. От языка ДНК он отличается одной буквой: копируя последовательность нуклеотидов, РНК-полимераза заменяет тимин на урацил (U). Кроме того, буквы РНК немного отличаются по «шрифту»: вместо дезоксирибозы в состав ее нуклеотидов входит рибоза.

Переписывание отдельных фраз — генов — из текста ДНК в текст РНК так и называется — транскрипция. А трансляцией на языке молекулярных биологов называется перевод с языка нуклеиновых кислот на язык белков из двух десятков букв, от A (или Ala — аланин) до V (или Val — валин). Аргинин в однобуквенной кодировке обозначается как R, аспарагин — N и так далее, и на всякий случай над столом у тех, кто этим постоянно занимается, висит табличка со шпаргалкой.

Любая рибосома (хотя вместо двух полушарий у нее есть только две белковые глобулы) знает этот алфавит наизусть и, прочитав на цепочке РНК слово «UUG», присоединяет к растущей цепочке белка аминокислоту триптофан, AAG или AAA — лизин, а дойдя до стоп-сигналов — UGA, UAG или UAA, — заканчивает синтез. Большинство аминокислот кодируется несколькими кодонами (от двух до шести). Например, команда «присоединяй лейцин» в половине случаев обозначается сочетанием CUG, по 10−20% приходится на CUU, CUC, UUG и UUA, а синоним CUA клетки используют очень редко.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Чертежи и программы

Если команде инженеров и рабочих дать задание построить действующую модель паровоза в натуральную величину, они для начала разберут изделие по винтику и потратят массу бумаги на тома технической документации. Работа живой клетки построена на известном всем программерам принципе открытых исходников — пользуйся, если знаешь как. Перед тем как начать перестраивать живые организмы, генные инженеры должны разобраться с текстом программ, записанных в хромосомах.

Геном бактерии прочитать относительно просто: единственная бактериальная хромосома содержит в среднем около трех тысяч генов, и вся информация о работе бактерии записана в нескольких миллионах пар нуклеотидов. Геном любого высшего организма — это миллиарды пар нуклеотидов, кодирующих десятки тысяч генов. К тому же в ДНК бактерий очень мало лишней информации, а у эукариотических (имеющих клеточное ядро) организмов, даже у одноклеточных дрожжей, ненужной информации в геноме больше, чем на жестком диске у самого дремучего «чайника». Бессмысленных последовательностей нуклеотидов, псевдогенов (дефектных копий истинных генов), интронов (участков ничего не кодирующей ДНК внутри генов) и другого мусора в нашей ДНК на порядок больше, чем осмысленной информации.

Прочитать геном — это только первый этап работы. После этого надо выделить из полученной последовательности нуклеотидов значащую информацию, понять, какой белок (или какую РНК) кодирует каждый ген (или хотя бы — в каком из генов закодирован нужный нам белок) и как белки взаимодействуют друг с другом. Введенный в хромосому ген может не заработать по множеству причин — например, из-за отсутствия в чужом геноме одного из десятков ферментов, необходимых для всех этапов синтеза конечного белка.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Каждый этап состоит из многих отдельных задач, для выполнения которых нужно произвести много отдельных операций, для каждой из которых необходимо оборудование, от пробирок и чашек Петри до сложных компьютеризированных комплексов, и реактивы — от дистиллированной воды до таких, которые стоят в тысячу раз дороже золота. Когда есть все необходимые материалы, инструменты и знания, можно начинать производство чего-нибудь генетически модифицированного. Например, ввести в хромосому мышиной яйцеклетки ген, выделенный из медузы, и любоваться мышкой, светящейся в темноте зеленым светом.

Инструменты для изготовления инструментов

Вспомните «Таинственный остров» Жюля Верна. Начального капитала у команды инженера Сайруса Смита было всего ничего — линза из часовых стекол да стальная полоска. Потом, правда, появился инвестор — капитан Немо, который подкинул им дополнительные вложения в виде носовых платков, ружей с боеприпасами и других предметов роскоши, а главное — минимум необходимых в хозяйстве инструментов. В результате робинзоны всего за несколько лет прошли путь от каменного века до телеграфа и других передовых достижений тогдашней техники. Но чтобы построить что-нибудь железное, кроме головы и рук необходимы железная руда и каменный уголь, а также чертежи и инструменты, с помощью которых можно сделать станки, а уже на них — изготовить необходимые для сборки конечного продукта детали.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

В биотехнологии каменный век закончился примерно в середине XIX столетия от Рождества Христова, когда Луи Пастер доказал, что причиной брожения являются дрожжи (он открыл еще много чего, но это — главное). Еще около ста лет в микробиологии, биохимии, генетике, органической химии и других науках происходило накопление критической массы знаний, которое в 70-х годах ХХ века привело к появлению современной молекулярной и клеточной биологии. Методы изучения живых объектов и воздействия на них становились все сложнее и эффективнее, но то, что происходило в лабораториях, долго оставалось чистой наукой — ученые делали чертежи и инструменты. Разница в том, что для перекройки ДНК используют не ножницы и клей, а молекулы ферментов, детали к месту сборки доставляют не вагонетки, а вирусы или потоки заряженных частиц.

Анализ и синтез

А теперь вспомните еще один шедевр — «Парк Юрского периода». Если предположить, что гены динозавров смогли сохраниться десятки миллионов лет — ДНК в капельке крови слишком мало для анализа. Но с тех пор, как в 1987 году Кэри Муллис изобрел полимеразную цепную реакцию (ПЦР), для изучения ДНК теоретически достаточно одной молекулы. В учебниках для будущих молекулярных биологов описание ПЦР занимает раза в два больше места, чем вся эта статья — не считая схем на разворот in folio. И это только один из методов, которые применяют при анализе и синтезе ДНК.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Что же такое ПЦР? Образец ДНК помещают в пробирку с ферментом ДНК-полимеразой, смесью из всех четырех нуклеотидов и раствором праймеров — синтетических участков из приблизительно 20 нуклеотидов, комплементарных участкам противоположных цепей ДНК на концах размножаемого образца (если неизвестно, что там у него на концах, приходится изворачиваться — например, с помощью метода дегенеративных праймеров). Потом раствор нагревают до 90−95° — двойная нить распадается на одиночные, охлаждают до 50° — праймеры присоединяются к комплементарным участкам, и нагревают до 70° — полимераза, используя праймеры как затравку, достраивает одиночные цепи до двойных. Цикл повторяется, и через 5 минут в растворе будет в 2 раза больше одинаковых двойных цепочек ДНК, через 10 минут — в 4, через полтора часа, после 20 циклов, — в миллион, а после тридцати циклов, через 2,5 часа, — в миллиард раз больше, чем в исходном растворе.

Давным-давно, почти 20 лет назад, когда ПЦР-анализ только придумали, пробирки с ДНК вручную переставляли из одной водяной бани в другую, а после каждого цикла добавляли в них новую порцию фермента вместо разложившегося при высокой температуре. Но очень скоро просто инженеры придумали для генных инженеров термоциркуляторы, а микробиологи выделили термостойкую ДНК-полимеразу из обитателя горячих источников — микроба Thermus aquaticus. Совсем недавно время процесса удалось сократить, заменив термическое расплетание двойной спирали добавкой фермента хеликазы (от греческого helix — спираль), которая именно этим и занимается в ядре клетки.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Секвенирование — определение последовательности нуклеотидов в ДНК — в середине 1970-х квалифицированный биохимик делал со скоростью несколько сотен нуклеотидов в год. В 2004 году в продажу поступил набор Discovery Kids DNA Explorer для научных работников старше 10 лет. Всего за $79,95 любой юный натуралист может в течение нескольких часов сделать анализ, на который ровесники его дедушки тратили несколько лет. А большие дяди и тети, если у них есть полмиллиона долларов, могут купить новейший автоматизированный секвенатор, который расшифровывает 800 000 нуклеотидов в день, и с умилением вспоминать седую древность начала 1990-х, когда примерно столько же делали за год тысячи участников программы «Геном человека». А один из методов секвенирования ДНК называется «выстрел из дробовика». Но к генным пушкам это не имеет никакого отношения.

Средства доставки

Генные пушки стреляют золотыми пулями размером от 1 до 4 микрон. Их покрывают частицами ДНК, вставляют в гильзы из капелек воды, заряжают в кассету, похожую на обычный холостой патрон, и с помощью сжатого воздуха стреляют в чашку Петри с клетками. Или разгоняют водяные брызги электрическим полем. Такую стрельбу по площадям применяют обычно в случаях, когда клетки не поддаются более точным методам доставки генов в хромосомы — например, для генетической модификации злаков или хвойных деревьев.

РЕКЛАМА – ПРОДОЛЖЕНИЕ НИЖЕ

Бактерии часто модифицируют с помощью плазмид — характерных для микробов колечек ДНК, на которых хранится несколько генов, несущих информацию, отсутствующую на основном носителе — хромосоме. Для этого из бактериальной клетки извлекают плазмиды, добавляют в них нужные гены и снова вводят в бактерию.

Являются ли плазмиды прирученными вирусами или, наоборот, вирусы — одичавшими плазмидами, — такая же неразрешимая загадка, как вопрос о первичности курицы или яйца. Вирусы используют для доставки генов и в плазмиды, и в хромосому бактерий. При делении микробов плазмиды распределяются между дочерними клетками случайным образом, и через несколько поколений потомки модифицированной бактерии могут выродиться в исходную форму или накопить в себе слишком много модифицированных плазмид. А если нужный исследователям ген ввести в ДНК вируса, который заражает не плазмидную, а хромосомную ДНК, трансформация будет более устойчивой.

Если же обезвреженным ретровирусом с подвешенными к нему генами заразить эмбрион, все его клетки при удачном стечении обстоятельств будут нести новый ген. Но грузоподъемность вируса ограничена — не более 8000 пар нуклеотидов. Не исключена и возможность серьезных осложнений. Например, при лечении тяжелого комбинированного иммунодефицита — единственной наследственной болезни, которую уже начали лечить с помощью генной терапии, — в 2 случаях из 12 побочным эффектом оказался рак крови. Поэтому при создании трансгенных животных чаще применяют метод микроинъекций ДНК.

Опытный лаборант за день может ввести трансгены в несколько сотен мужских пронуклеусов (ядро сперматозоида перед его слиянием с более мелким ядром яйцеклетки). В лучшем случае из 5% «прооперированных» яйцеклеток рождаются жизнеспособные и несущие нужный ген животные. Их скрещивают между собой, и в соответствии с законами Менделя во 2-м поколении у каждого четвертого животного в хромосомном наборе оказываются две копии нового гена. После скрещивания таких — гомозиготных — животных третье и все последующие поколения будут полностью трансгенными.

А для создания генетически модифицированных растений самой удобной системой доставки оказались почвенные бактерии — Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes. О том, как и зачем это делают, читайте в следующем номере.

Загрузка статьи...